Introducción
La purificación de biomoléculas a partir de alimentos complejos suele realizarse mejor mediante combinaciones de métodos de separación ortogonales. Hemos investigado la captura de un péptido sintético con residuos de 45 aminoácidos utilizando WorkBeads™ 40S, una resina de intercambio catiónico a base de agarosa.
Esta resina tiene propiedades óptimas de flujo-presión y es estable frente a una limpieza eficiente en condiciones alcalinas fuertes. Esto lo convierte en una excelente herramienta para la purificación de péptidos terapéuticos a partir de alimentos crudos después de la síntesis en fase sólida o después de la expresión recombinante. El paso de captura reduce la contaminación irreversible de la columna de cromatografía de fase reversa (RPC) basada en sílice de alto rendimiento aguas abajo.
Las condiciones de unión y elución se optimizaron para WorkBeads 40S y Capto™ SP ImpRes (GE Healthcare) y se comparó el rendimiento óptimo de cada resina.
Resultados
La capacidad de unión dinámica (DBC) se analizó mediante análisis frontal a diferentes caudales utilizando péptido puro (10 g/l) aplicado en condiciones de unión optimizadas y se determinó con un avance del 10 %. La Figura 1 muestra la curva de avance de WorkBeads 40S; consulte las condiciones a continuación.
Figura 1. Capacidad de unión dinámica determinada mediante análisis frontal.
El DBC fue de 151 mg/ml a 75 cm/h y de 140 mg/ml a 300 cm/h (ver Fig. 2). Se determinó que el DBC para WorkBeads 40S y Capto SP ImpRes era 150 mg/ml y 125 mg/ml, respectivamente, con un tiempo de residencia de 2 minutos (consulte la Tabla 1). Los valores fueron 140 mg/ml y 123 mg/ml, respectivamente, con un tiempo de residencia de 1,1 minutos, lo que indica un excelente transporte de masa, respaldado también por la rápida cinética de desorción.
Figura 2. DBC versus flujo lineal determinado para WorkBeads 40S en la columna utilizada en la Figura 1.
Tabla 1. Capacidades de encuadernación dinámica para WorkBeads 40S y Capto SP ImpRes.
Se purificó una alimentación con una pureza del 55 % con WorkBeads 40S y Capto SP ImpRes para establecer cuál de las resinas proporciona la combinación más óptima de pureza y rendimiento (Fig. 3).
Figura 3. Purificación de un péptido residual de 45 aminoácidos a partir de un 55 % de alimentación cruda. Se muestran rastros de UV para WorkBeads 40S (azul) y Capto SP ImpRes (rojo).
El péptido diana se recogió para mantener el mismo rendimiento (92%) en ambas columnas. La pureza obtenida con una carga de 30 g/l fue del 91,8% para WorkBeads 40S y del 85,2% para Capto SP ImpRes. La pureza aumentó al 93,0 % en WorkBeads 40S cuando la carga se redujo a 10 g/l de resina.
Tabla 2. Pureza obtenida con una carga de 30 g/l de una alimentación cruda que contiene 55% de péptido diana.
El material preparado con WorkBeads 40S (Fig. 3) se sometió a un paso de pulido usando una columna de sílice RPC (no mostrada) para obtener la pureza final del 99 % de este péptido terapéutico (Fig. 4).
Figura 4. Análisis de pureza por RPC. (A) Alimentación cruda (traza azul), péptido purificado en WorkBeads 40S (traza verde). (B) producto final después del pulido RPC.
Conclusiones
Los resultados demuestran una mejora significativa de la pureza utilizando un paso de intercambio iónico ortogonal a base de agarosa antes del pulido final mediante RPC. Investigaciones adicionales promoverán la comprensión de la ganancia en productividad para el paso RPC al poder realizar una mayor carga de alimento, reducir la contaminación y aumentar la vida útil de la columna.
Capto es una marca comercial de General Electric Company.
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