La “síntesis de péptidos” abarca la preparación de una amplia gama de sustancias, desde simples péptidos de moléculas pequeñas hasta proteínas de gran tamaño. La introducción pionera de Bruce Merrifield de la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) transformó fundamentalmente las estrategias de síntesis de péptidos al simplificar los engorrosos y altamente exigentes pasos de purificación necesarios en la síntesis tradicional de péptidos en fase líquida (LPPS).

Principios básicos de SPPS

La síntesis de péptidos implica una gran cantidad de pasos repetitivos y el uso de un soporte sólido ofrece importantes ventajas. En un sistema de este tipo, las altas concentraciones de reactivos en exceso pueden llevar a que se completen las reacciones de acoplamiento, mientras que los reactivos y subproductos excedentes se pueden separar de la cadena peptídica (resina) en crecimiento insoluble simplemente mediante filtración y lavado. Todas las operaciones se llevan a cabo en el mismo solvente, eliminando la necesidad de transferencia de material.

• Anclaje del aminoácido inicial: El aminoácido inicial se ancla a la resina a través de su extremo C, formando un enlace éster o un enlace amida.
• Ensamblaje lineal: la cadena peptídica se alarga paso a paso desde el extremo C al extremo N mediante reacciones de condensación.
• Estrategia de grupo protector: se utilizan grupos protectores permanentes para las cadenas laterales para mejorar la estabilidad; La protección de los aminoácidos sin cadena lateral se logra generalmente utilizando grupos protectores de tipo carbamato, que pueden eliminarse en condiciones suaves, evitando así la racemización causada por condiciones demasiado duras.
• Operaciones cíclicas: Acoplamiento, lavado para eliminar el exceso de reactivos, desprotección e inicio del siguiente ciclo de acoplamiento.
• Escisión final: la cadena peptídica se escinde de la resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de la cadena lateral.

Estrategia Fmoc/t-Bu en síntesis en fase sólida

En la síntesis en fase sólida se utilizan principalmente dos estrategias principales de grupos protectores: Boc/Bzl y Fmoc/t-Bu. El primero requiere desprotección en condiciones ácidas relativamente fuertes, como TFA, y se utiliza principalmente para la protección de las cadenas laterales. Las condiciones de acidez fuerte a menudo dañan las secuencias de aminoácidos sensibles; por lo tanto, la estrategia Fmoc/t-Bu generalmente se adopta para la protección de aminoácidos, en la que Fmoc es lábil a las bases y t-Bu es lábil a los ácidos débiles. Los métodos de síntesis en fase sólida que utilizan la estrategia basada en Fmoc se han convertido en el enfoque preferido para la síntesis de péptidos de rutina.

Soportes sólidos

Los soportes sólidos pueden caracterizarse tanto por el “polímero de matriz” como por la “molécula conectora”, aunque el término “resina” a menudo se utiliza incorrectamente para referirse al sistema completo. En la química en fase sólida, el polímero matriz es tan importante como el entorno en fase líquida. Actualmente existen en el mercado más de cien resinas, algunas de las cuales están provistas de las mismas moléculas enlazadoras. Por lo tanto, se debe seleccionar cuidadosamente el enlazador más adecuado durante la síntesis.

Las resinas a base de poliestireno reticulado (PS) son soportes sólidos comúnmente utilizados para SPPS. Las perlas de resina con una distribución de tamaño de partícula de malla 200-400 (aproximadamente 50 μm de diámetro) y una carga de 0,5-0,8 mmol/g exhiben buenas propiedades de hinchamiento en DMF y DCM, lo que promueve la difusión de los reactivos en la matriz polimérica y garantiza un acceso adecuado a los sitios enlazadores enterrados dentro de las perlas. Para cadenas peptídicas más largas (más de 25 aminoácidos) o secuencias que son más difíciles de sintetizar, se deben utilizar resinas de carga inferior de 0,1-0,2 mmol/g. Las resinas a base de poliamida (PA) reticulada y las resinas compuestas de poliestireno-polietilenglicol (PS-PEG) son soportes sólidos más hidrófilos. Sus propiedades físicas microscópicas y macroscópicas difieren de las de las resinas PS. Estos soportes generalmente tienen capacidades de carga más bajas y pueden servir como alternativas al PS para la síntesis de secuencias complejas y péptidos grandes.

Manipulación de resina

¿Por qué se deben tratar las resinas antes de su uso? Esto es análogo al teñido y acabado de textiles. Debido a que las fibras de algodón tienen secciones transversales ovaladas irregulares, deben hincharse antes de teñirlas para aumentar la superficie y que los tintes puedan penetrar eficazmente. La resina es un material polimérico con cadenas largas que pueden enredarse o colapsar estructuralmente, y sus sitios reactivos se encuentran dentro de la resina. Por lo tanto, es esencial realizar un tratamiento de hinchazón antes de su uso y también se deben tener en cuenta las condiciones de reacción.

Selección del reactor

Recipiente de reacción SPPS: el reactor generalmente está hecho de vidrio y está equipado con una jeringa de PTFE o frita de vidrio. El tamaño del reactor debe seleccionarse según la cantidad de resina utilizada.

Tipos de reactores SPPS

Selección de solventes

El noventa y nueve por ciento de los sitios de acoplamiento no están ubicados en la superficie de las perlas de resina sino dentro de la resina. Por lo tanto, las perlas de resina que llevan la cadena peptídica en crecimiento deben estar completamente hinchadas para asegurar una penetración óptima de los aminoácidos activados protegidos en la matriz polimérica, mejorando así la eficiencia del acoplamiento.

El procedimiento básico de hinchamiento es el siguiente: antes de comenzar la síntesis en fase sólida, coloque la resina en un disolvente adecuado como DMF o DCM y déjela hincharse durante 20 a 30 minutos. Para las perlas de resina a base de poliestireno (PS) reticulado, el DCM proporciona las mejores características de hinchamiento. Sin embargo, durante la etapa de acoplamiento se prefiere DMF o NMP porque estos disolventes proporcionan una mejor solubilidad para los reactivos. Los alcoholes y el agua no son adecuados para resinas a base de poliestireno (PS) reticulado. Sin embargo, en etapas de lavado posteriores, se puede usar metanol o isopropanol para encoger las perlas de resina y expulsar el exceso de reactivos atrapados. Después de este tratamiento, las perlas deben volverse a hinchar con DCM y DMF. Procedimiento de hinchamiento de la resina: coloque la resina en un reactor adecuado, agregue DCM hasta que las perlas de resina estén completamente sumergidas y mezcle suavemente la suspensión de resina con una varilla agitadora de PTFE. Deje que se hinche durante 20 a 30 minutos y luego elimine el disolvente mediante filtración al vacío.

Revolver y mezclar

Durante SPPS, la cinética de reacción se rige principalmente por fenómenos de difusión; por lo tanto, es innecesaria la agitación vigorosa del recipiente de reacción. Además, la mayoría de las perlas de resina utilizadas en la síntesis de péptidos son relativamente frágiles y una agitación fuerte puede dañarlas o fracturarlas. Se puede lograr una mezcla suave usando el rotor de un evaporador rotatorio o empleando dispositivos capaces de realizar movimientos suaves, como balanceo o mezcla en forma de vórtice.

Lavado

El lavado se utiliza para eliminar los subproductos solubles y el exceso de reactivos generados durante el acoplamiento y la desprotección. El procedimiento de lavado básico implica introducir disolvente en el reactor y luego retirarlo al vacío; cuando sea necesario, la resina se puede agitar suavemente en el disolvente de lavado con una varilla agitadora.

Procedimiento estándar de lavado y reswelling: agregue DMF al recipiente de reacción, déjelo reposar durante 10 s, luego retire el solvente mediante filtración al vacío, enjuagando cuidadosamente todas las partes del reactor con DMF. Retire el solvente al vacío, luego agregue nuevamente solvente nuevo para lavar, repitiendo la operación 1-2 veces. Una vez completado el lavado, lave la resina con metanol utilizando un procedimiento similar al paso de lavado con DMF, repitiendo 1-2 veces. Luego cambie a DCM para lavar 1 o 2 veces, seguido de DMF 1 a 2 veces.

Selección de enlazadores y resinas en la síntesis en fase sólida de Fmoc

El primer paso en SPPS es anclar el residuo de aminoácido C-terminal (con su extremo N protegido) al soporte sólido a través de un enlace éster o un enlace amida, dependiendo de si el péptido objetivo tiene un ácido carboxílico C-terminal o un grupo amida C-terminal. En la actualidad, la mayoría de las moléculas conectoras están disponibles comercialmente y precargadas en diferentes matrices, incluidas matrices compuestas de poliestireno (PS), poliamida (PA) y poliestireno-polietilenglicol (PS-PEG). Los ácidos peptídicos C-terminales se generan a través de enlaces éster, mientras que las amidas peptídicas C-terminales se generan a través de enlaces amida. Estos enlazadores precargados simplifican la preparación experimental y garantizan la coherencia entre lotes. Las diferentes matrices tienen características diferentes: las matrices de PS son altamente hidrófobas y adecuadas para la síntesis de péptidos de rutina; Las matrices de PS-PEG son más hidrófilas y ventajosas para la síntesis de péptidos largos; y la poliamida (PA) se utiliza para aplicaciones especializadas.

Amidas peptídicas

Para la síntesis de amidas peptídicas C-terminales, se utilizan habitualmente las siguientes resinas. La unión del primer aminoácido a estas resinas es básicamente consistente con la estrategia de síntesis de Fmoc, y bajo tratamiento con TFA, estas resinas dejan un enlace amida tras la escisión para completar la liberación del péptido (la resina funciona de manera similar a un grupo protector). Debido a que estas resinas contienen grupos amino libres, generalmente están protegidas con Fmoc y deben desprotegerse antes de su uso. Cabe señalar que cuando se acoplan a la resina aminoácidos con impedimento estérico sustancial en el extremo C, puede ocurrir una conversión incompleta y puede ser necesaria una segunda etapa de acoplamiento.

Ácidos peptídicos

En comparación con la nucleofilicidad de los grupos amino, los grupos hidroxilo son menos nucleofílicos. Por lo tanto, anclar aminoácidos sobre un soporte sólido en forma de ésteres es más desafiante. Se recomienda comprar directamente resinas precargadas con el aminoácido C-terminal protegido para evitar problemas como la epimerización, la formación de dipéptidos y la variabilidad del nivel de sustitución. Al sintetizar ácidos peptídicos C-terminales utilizando la estrategia Fmoc/tBu, la reacción de anclaje debe llevarse a cabo en condiciones anhidras y los aminoácidos que contienen humedad deben secarse previamente.

Resinas de hidroxilo

Entre las resinas hidroxilo, la resina Wang, con menos impedimento estérico, forma más fácilmente enlaces éster y se utiliza comúnmente el método del anhídrido simétrico. Si el anclaje es difícil, se puede repetir el paso de esterificación con reactivos nuevos; algunos derivados de aminoácidos pueden requerir tres ciclos de esterificación para lograr resultados satisfactorios. Una vez completado el anclaje, se recomienda tapar los grupos hidroxilo que no han reaccionado en la resina con anhídrido benzoico o anhídrido acético. Procedimiento operativo estándar para resinas de hidroxilo: primero coloque la resina en el reactor e hinche con un disolvente adecuado. Mientras tanto, disolver el aminoácido objetivo protegido con Fmoc (10,0 eq.) en DCM a 0 °C, añadir DIC (5,0 eq.) y dejar activar durante 10 minutos; Se puede agregar DMF si es necesario para ayudar a la disolución. Transfiera la solución activada a la resina, agregue DMAP/DMF para catalizar la reacción y agite durante 1 hora; luego lave una vez con DMF y DCM. Secar al vacío durante 18 horas y determinar la carga mediante el ensayo de liberación de Fmoc. Si la carga es inferior al 70%, se debe repetir el paso de esterificación.

Una vez alcanzada la carga objetivo, tapar los grupos hidroxilo residuales con anhídrido benzoico/anhídrido acético (5 eq.) y piridina (1 eq.) en DMF durante 30 minutos. Después del lavado final y la desprotección de Fmoc, puede comenzar el alargamiento de la cadena peptídica. Este procedimiento garantiza la eficiencia del acoplamiento mediante activación a baja temperatura, control estequiométrico estricto y verificación de carga. Los pasos clave incluyen el monitoreo de la activación, la mejora catalítica y la limitación de hidroxilo para evitar la formación de subproductos.

Resinas de la serie Tritilo

Estas resinas exhiben una alta labilidad ácida y el impedimento estérico de sus grupos enlazadores puede suprimir significativamente la formación de dicetopiperazina (DKP). Están especialmente recomendados para la síntesis de péptidos con prolina C-terminal (Pro) o glicina (Gly). Estas resinas se pueden escindir en condiciones ácidas extremadamente suaves, protegiendo así tanto el segmento peptídico como la resina. Los productos comerciales se suministran generalmente como resina de clorotritilo o precursores de alcohol tritílico.

Procedimiento típico para resina de tritilo: Coloque 1 g de resina de tritilo (cargando 1,0-2,0 mmol de cloruro/g) en un reactor SPPS y deje que se hinche. Añadir 3 equivalentes del aminoácido Fmoc y 7,5 equivalentes de DIPEA, luego agitar a temperatura ambiente en DCM anhidro durante 30-60 minutos. Lave la resina secuencialmente con DMF 2-3 veces, luego agregue 10 ml de una mezcla de DCM/MeOH/DIPEA para tapar los grupos cloruro residuales y continúe la reacción durante 15 minutos. Finalmente, lave tres veces con DMF y DCM, seque al vacío y determine la carga mediante el ensayo de liberación de Fmoc. A través de este procedimiento, el control preciso de la proporción de aminoácidos a DIPEA, junto con la extinción del metanol, garantiza la unión en un solo sitio. Cabe señalar que la actividad del cloruro de tritilo debe mantenerse en condiciones anhidras.