Introducción
La tecnología del ADN recombinante se ha utilizado durante mucho tiempo para producir insulina terapéutica y, dado que la mayor parte del costo de fabricación (más del 90%) de la insulina está asociada con la recuperación y la purificación, ser competitivo significa maximizar el rendimiento de la insulina de alta pureza. Además, los requisitos de pureza, como para cualquier producto biofarmacéutico, son muy estrictos y normalmente se cumplen mediante el uso de cromatografía de fase reversa (RPC) de alta resolución con resinas a base de sílice. Sin embargo, las impurezas de la alimentación (carga biológica) a menudo causan suciedad en la columna. El método común de limpieza in situ con hidróxido de sodio está limitado a las resinas de sílice, por lo que estas impurezas son difíciles de eliminar. La introducción de un paso de purificación ortogonal aguas arriba reduce significativamente la carga de la costosa y de alto rendimiento de la columna RPC, lo que aumenta el rendimiento y la pureza del péptido y también prolonga la vida útil de la columna.
Resultados
La alimentación para el proceso de purificación de péptidos contenía un 72,5 % de precursor de insulina humana pura (Met-Lys-Insulina humana), Figura 1A. Cada paso de purificación se optimizó y las fracciones se combinaron para dar un rendimiento del 90 % con la mayor pureza posible.
Un tercer paso de purificación después del extracto se aplicó a una columna con WorkBeads 40S. En la Tabla 1 se muestra una comparación con Capto SP ImpRes (GE Healthcare) como paso de captura. Se observó una mayor pureza al usar WorkBeads 40S en el paso de captura.
tabla 1. Comparación de pureza entre WorkBeads 40S y Capto SP ImpRes para un rendimiento del conjunto del 90 %.
La limpieza mediante purificación CIEX minimizó las impurezas que se aplicarán en el segundo y tercer paso de purificación basado en RPC. Se utilizó la misma columna RPC en ambos pasos, aunque las condiciones fueron diferentes.
Las condiciones optimizadas y los cromatogramas se muestran en la Tabla 2 y la Figura 1. La pureza final del proceso de tres pasos fue del 99,7%. La Tabla 3 muestra la pureza después de cada paso del proceso.
tabla 2. Proceso de purificación en tres pasos de un precursor de insulina humana recombinante
figura 1. Análisis RPC de piscinas purificadas a partir de la purificación optimizada en tres pasos. Alimentación (A), paso 1: conjunto eluido de WorkBeads 40S (B), paso 2: conjunto eluido de RPC1 (C) y paso 3: conjunto eluido de RPC2, producto final (D).
tabla 3. Pureza obtenida durante el proceso optimizado de purificación en tres pasos del precursor de insulina humana recombinante
Conclusión y comentarios
Al introducir un paso de cromatografía de intercambio catiónico (CIEX) aguas arriba del paso de RPC de alto rendimiento a base de sílice, la carga de impurezas se redujo significativamente, del 27,5 % al 12 %. Esta formación mejorada minimiza la contaminación de la columna RPC y la necesidad de limpieza in situ. Por tanto, el uso de WorkBeads 40S puede prolongar significativamente la vida útil de las columnas RPC posteriores. La pureza final del proceso fue del 99,7%, muy por encima del objetivo del 99%.
WorkBeads 40S proporcionó una pureza mayor que Capto SP ImpRes, en el paso de captura CIEX introducido, lo que resultó en un paso de captura más eficiente y, además, también mejoró la selectividad.
